3/1:20423
2.4.23. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТЕРИНОВ В ЖИРНЫХ МАСЛАХ
При отсутствии в частной монографии ссылки на метод определения, применяют
метод А. Любое изменение от метода А к методу В должно быть валидировано.
МЕТОД А
Отделение стериновой фракции (ТСХ)
Получают неомыляемые вещества жирного масла и затем отделяют стериновую фракцию
методом тонкослойной хроматографии (2.2.27), используя ТСХ пластинку со слоем
силикагеля Р толщиной от 0.2 мм до 0.5 мм.
Испытуемый раствор (а). В колбу вместимостью 150 мл, снабженную обратным
холодильником, помещают объем 2 г/л раствора бетулина Р в метиленхлориде Р,
соответствующего около 10 % бетулина от содержания стерина в образце, взятом для
определения (например, в случае оливкового масла прибавляют 500 мкл, в случае других
растительных масел – 1500 мкл раствора бетулина). При наличии в частной монографии
указания на определение процентного содержания стеринов в стериновой фракции, то
раствор бетулина допускается не прибавлять. Упаривают досуха в токе азота Р,
прибавляют 5.00 г (m) испытуемого образца, добавляют 50 мл 2 М калия гидроксида
спиртового раствора Р и нагревают на водяной бане в течение 1ч, часто перемешивая
содержимое колбы круговыми движениями. Охлаждают до температуры ниже 25 °С и с
помощью 100 мл воды Р количественно переносят содержимое колбы в делительную
воронку. Осторожно встряхивают с тремя порциями эфира, свободного от пероксидов, Р
по 100 мл. Объединенные эфирные слои помещают в другую делительную воронку,
содержащую 40 мл воды Р, осторожно встряхивают в течение нескольких минут,
выдерживают до расслоения и отбрасывают водный слой. Эфирный слой промывают
несколькими порциями воды Р по 40 мл до тех пор, пока водный слой не перестанет
давать щелочную реакцию по фенолфталеину. Эфирный слой переносят в предварительно
взвешенную колбу, промывая делительную воронку эфиром, свободным от пероксидов,
Р. Эфир отгоняют с необходимыми предосторожностями и прибавляют к остатку 6 мл
ацетона Р. Осторожно удаляют растворитель в токе азота Р, остаток сушат до
постоянной массы при температуре от 100 °С до 105 °С, охлаждают в эксикаторе и
взвешивают. Остаток переносят в небольшую пробирку с помощью метиленхлорида Р.
Упаривают в токе азота до объема около 1 мл. В зависимости от неомыляемого
содержимого масла концентрацию раствора доводят до (25 – 50) мг/мл.
Испытуемый раствор (b). 5.00 г рапсового масла Р обрабатывают в соответствии с
указаниями для испытуемого образца, начиная со слов «добавляют 50 мл 2 М калия
гидроксида раствора спиртового Р».
Испытуемый раствор (с). 5.00 г подсолнечного масла Р обрабатывают в соответствии с
указаниями для испытуемого образца, начиная со слов «добавляют 50 мл 2 М калия
гидроксида раствора спиртового Р».
Раствор сравнения. 25 мг холестерина Р и 10 мг бетулина Р растворяют в 1 мл
метиленхлорида Р.
Для каждого испытуемого раствора используют отдельную пластинку.
Условия хроматографирования:
– ТСХ пластинка со слоем силикагеля G Р;
– подвижная фаза: эфир Р – гексан Р (35:65, об/об);
– объем наносимый пробы: 10 мкл раствора сравнения (на расстоянии 20 мм от основания
и 10 мм от левого края в виде полоски размером 10 мм);
– по 0.5 мл испытуемых растворов (а), (b), или (с) (на расстоянии 20 мм от основания в
виде полоски размером 150 мм);
– пробег фронта подвижной фазы: 17 см от линии старта;
– высушивание: в токе азота Р;
– детектирование: в ультрафиолетовом свете при длине волны 254 нм после
опрыскивания раствором 2 г/л дихлорфлуоресцеина Р в этаноле безводном Р.
На хроматограмме раствора сравнения обнаруживаются полосы, соответствующие
холестерину и бетулину. На хроматограммах испытуемых растворов обнаруживаются
полосы со значениями RF, соответствующим стеринам. С хроматограммы каждого
испытуемого раствора снимают слой силикагеля с полосами стеринов, а также
дополнительно силикагель на (2 – 3) мм выше и ниже видимых зон, соответствующих
раствору сравнения, и помещают раздельно в три колбы вместимостью по 50 мл. В
каждую колбу прибавляют по 15 мл метиленхлорида Р и нагревают в течение 15 мин с
обратным холодильником при перемешивании. Каждый раствор пропускают через
стеклянный фильтр (40) (2.1.2) или подходящую фильтровальную бумагу и промывают
каждый фильтр тремя порциями метиленхлорида Р по 15 мл. Каждый из трех
объединенных фильтратов и смывов помещают в три колбы, упаривают в токе азота Р до
объема от 5 мл до 10 мл. Переносят содержимое каждой колбы в небольшие пробирки и
упаривают в токе азота Р досуха.
Требование:
– на хроматограмме раствора сравнения обнаруживаются полосы, соответствующие
холестерину и бетулину;
– на хроматограммах испытуемых растворов обнаруживаются полосы со значениями RF,
соответствующим стеринам.
Определение стеринов (методом газовой хроматографии)
Определение проводят методом газовой хроматографии (2.2.28).
Все операции проводят, защищая от влаги; растворы готовят непосредственно перед
применением.
Испытуемый раствор. К стеринам, выделенным из испытуемого образца методом
тонкослойной хроматографии, прибавляют свежеприготовленную смесь 0.04 мл
хлортриметил- силана Р, 0.1 мл гексаметилдисилазана Р и 0.5 мл пиридина безводного Р
и выдерживают не менее 5 мин; используют жидкую фазу.
Раствор сравнения (а). К 9 частям стеринов, выделенных из рапсового масла Р методом
тонкослойной хроматографии, прибавляют 1 часть холестерина Р. К полученной смеси
добавляют свежеприготовленную смесь 0.04 мл хлортри- метилсилана Р, 0.1 мл
гексаметилдисилазана Р и 0.5 мл пиридина безводного Р и выдерживают не менее 5 мин;
используют жидкую фазу.
Раствор сравнения (b). К стеринам, выделенным из подсолнечного масла Р методом
тонкослойной хроматографии, прибавляют свежеприготовленную смесь 0.04 мл
хлортриметил- силана Р, 0.1 мл гексаметилдисилазана Р и 0.5 мл пиридина безводного Р
и выдерживают не менее 5 мин; используют жидкую фазу.
Условия хроматографирования:
– колонка: из термостойкого кварца капиллярная, длиной от 20 м до 30 м и внутренним
диаметром от 0.25 мм до 0.32 мм, заполненная поли[метил(95)фенил(5)]силоксаном Р
или поли(цианопропил)(7)(фенил)(7)(метил)(86)силоксаном Р толщиной 0.25 мкм;
– газ-носитель: водород для хроматографии Р или гелий для хроматографии Р;
– линейная скорость газа-носителя: (30-50) см/с (водород) или (20 - 35) см/с (гелий);
– деление потока: 1:50 (водород) или 1:100 (гелий);
– температура колонки: 260 °С;
– температура блока для ввода проб: 280 °С;
– температура детектора: 290 °С;
– детектор: пламенно-ионизационный;
– объем вводимой пробы: по 1 мкл испытуемого раствора, растворов сравнения (а) и (b).
Идентификация пиков: на хроматограмме раствора сравнения (а) обнаруживаются четыре
основных пика, соответствующие холестерину, брассикастерину, кампестерину и β-
ситостерину; на хроматограмме раствора сравнения (b) обнаруживаются четыре основных
пика, соответствующие кампестерину, стигмастерину, β-ситостерину и ∆7-стигмастенолу.
Относительные времена удерживания пиков стеринов по отношению к пику β -
ситостерина приведены в таблице 2.4.23.-1.
Таблица 2.4.24.-1. – Относительные времена удерживания пиков стеринов по отношению
к пику β -ситостерина для двух различных колонок
Стерины
Поли(цианопропил)(7)-
(фенил)(7)-
(метил)(86)силоксан
Поли [метил(95)фенил-(5)]
силоксан
Холестерин
0.64
0.63
Брассикастерин
0.70
0.71
24-Метиленхолестерин
0.79
0.80
Кампестерин
0.82
0.81
Кампестанол
0.83
0.82
Стигмастерин
0.87
0.87
∆7-Кампестерин
0.93
0.92
∆5,23-Стигмастадиенол
0.95
0.95
Клеростерин
0.96
0.96
β -Ситостерин
1
1
Ситостанол
1.01
1.02
∆5-Авенастерин
1.03
1.03
∆5,24-Стигмастадиенол
1.09
1.08
∆7-Стигмастенол
(1)
1.13
1.12
∆7-Авенастерин
1.18
1.16
Бетулин
1.4
1.4
(1)
В литературе данный стерин может быть также называться ∆7-стигмастерином.
Пик внутреннего стандарта (бетулин) должен быть четко отделен от пиков определяемых
стеринов. Идентифицируют пики, обнаруженные на хроматограмме испытуемого
раствора.
Содержание каждого стерина в стериновой фракции испытуемого раствора рассчитывают
в процентах по формуле:
х 100
где:
Si — площадь пика стерина на хроматограмме испытуемого раствора;
∑Si — сумма площадей всех пиков стеринов, указанных в таблице 2.4.24. 1., кроме
пика бетулина.
При наличии указаний в частной монографии рассчитывают содержание каждого стерина
в стеариновой фракции испытуемого образца в процентах по формуле:
где :
S – площадь пика определяемого стерина на хроматограмме испытуемого
раствора;
S
0
– площадь пика бетулина на хроматограмме раствора сравнения;
m – масса навески испытуемого образца в граммах;
m
0
– масса навески добавленного бетулина Р в миллиграммах.
МЕТОД В
Приготовление неомыляемых веществ
Неомыляемые вещества готовят методом, описанным в испытании на неомыляемые
вещества в частной монографии на испытуемый образец. При отсутствии данного
метода, неомыляемые вещества готовят методом, описанным в разделе 2.5.7.
Неомыляемые вещества. После стадии нейтрализации этанол (96 %) Р упаривают,
затем прибавляют 6 мл ацетона Р и упаривают растворитель. Остаток сушат при
температуре от 100 °С до 105 °С. Не требуется высушивание его до постоянной массы.
Параллельно в таких же условиях готовят неомыляемые вещества подсолнечного
масла Р, используемые, в частности, для идентификации стериновой фракции,
которую следует собрать.
Отделение стериновой фракции (методом жидкостной хроматографии)
Отделение стериновой фракции проводят методом жидкостной хроматографии.
(2.2.29).
Испытуемый раствор. Высушенный остаток неомыляемых веществ переносят тремя
порциями по 4 мл растворителя, используемого при получении неомыляемых веществ
(обычно эфир Р или петролейный эфир Р), в пробирку вместимостью 15 мл,
упаривают досуха в токе азота Р. Остаток растворяют в объеме подвижной фазы,
достаточном для получения концентрации около 40 мг/мл, прибавляют несколько
капель 2-пропанола Р1 для улучшения растворимости (обычно достаточно трех капель
для обеспечения полного растворения). Полученный раствор пропускают через
мембранный фильтр с размером пор 0.45 мкм.
Раствор сравнения. Готовят из неомыляемых веществ, полученных из подсолнечного
масла Р в соответствии с указаниями для испытуемого раствора.
Условия хроматографирования:
– предколонка: из нержавеющей стали длиной 5 мм и внутренним диаметром 4.6 мм,
покрытая слоем силикагеля для хроматографии Р с размером частиц 5 мкм и
размером пор 6 нм;
– колонка: из нержавеющей стали длиной 0.25 м и внутренним диаметром 4.6 мм,
покрытая слоем силикагеля для хроматографии Р с размером частиц 5 мкм и
размером пор 6 нм;
– подвижная фаза: 2-пропанол Р1 – гексан Р (1:99, об/об);
– скорость подвижной фазы: 1.0 мл/мин;
– детектор: ультрафиолетовой, длина волны 210 нм;
– объем вводимой пробы: по 50 мкл испытуемого раствора и раствора сравнения.
Идентификация пиков стеринов (раствор сравнения): обнаруживаются два основных
пика, элюирующимися примерно между 23 мин и 32 мин. Пики фракции стеринов
элюируются в конце хроматограммы. Фракцию собирают на выходе детектора в
пробирку с винтовой крышкой вместимостью 15 мл. Растворитель упаривают в токе
азота Р.
Определение стеринов (методом газовой хроматографии)
Определение стеринов проводят методом газовой хроматографии (2.2.28).
Испытуемый раствор. Растворяют фракцию стеринов, выделенную из испытуемого
раствора методом тонкослойной хроматографии на предыдущем этапе, в смеси 0.2 мл
пиридина безводного Р и 0.2 мл смеси хлортриметисилан Р-НО-
бис(триметилсилил)трифторацетамид Р (1:99, об/об), пробирку плотно закрывают
пробкой и нагревают при температуре 80 °С в течение 20 мин. Затем охлаждают и
используют жидкую фазу.
Раствор сравнения. Растворяют фракцию стеринов, выделенную из раствора
сравнения методом тонкослойной хроматографии на предыдущем этапе, в смеси 0.2
мл пиридина безводного Р и 0.2 мл смеси хлортриметисилана Р - N,O
бис(триметилсилил)трифторацетамида Р (1:99, об/об), пробирку плотно закрывают
пробкой и нагревают при температуре 80 °С в течение 20 мин. Затем охлаждают и
используют жидкую фазу.
Стандартный образец холестерина (холестерин Р) также может быть использован
отдельно или в смеси со стериновой фракцией подсолнечного масла. Дериватизацию
проводят в соответствии с указаниями для испытуемого раствора.
Условия хроматографирования:
– колонка: капиллярная колонка из термостойкого кварца, длиной 30 м и внутренним
диаметром 0.25 мм, покрытая слоем поли[ме- тил(95)фенил(5)]силоксаном Р
толщиной 0.25 мкм;
– газ-носитель: гелий для хроматографии Р;
– скорость газа-носителя: 2.6 мл/мин;
– деление потока: 1:25;
– объем вводимой пробы: 1-3 мкл (в зависимости от ожидаемого количества стеринов в
испытуемом растворе);
– режим изменения температуры:
Элемент
Время (мин)
Температура (°С)
Колонка
0-38
38-44
44-49
260
260→ 290
290
Блок для ввода проб
290
Детектор
290
Идентификация пиков (раствор сравнения): пики кампестерина, стигмастерина, β -
ситостерина и ∆7-стигмастенола, стеринов и относительные удерживания пиков по
отношению к пику β –ситостерину приведены в таблице 2.4.23.-1.
Пригодность системы (раствор сравнения):
– разрешение: не более 4.0 между пиками кампестерина и стигмастерина.
Содержание каждого стерина в стериновой фракции испытуемого образца в
процентах рассчитывают по формуле:
х 100
где:
Si – площадь пика определяемого стерина на хроматограмме испытуемого
образца;
∑Si – сумма площадей всех пиков стеринов, указанных в таблице 2.4.24.-1,
кроме пика бетулина.
